ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ТТV В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
Аннотация
Введение. Исследование биологического материала на наличие ДНК TTV методом ПЦР позволяет своевременно оценить функциональное состояние печени и иммунной системы человека. Цель исследования – создание компонентов для проведения ПЦР в режиме реального времени для обнаружения ДНК TTV в биологическом материале. Материал и методы. Проведены конструирование и подбор оптимальных праймеров и зондов с учетом размера (длины) ампликона, температуры отжига, нуклеотидного состава, распределения нуклеотидов по длине праймера, длины праймеров; возможности образования праймерами шпилек и димеров определяли с помощью программ Primer-BLAST/Primer3, FastPCR. Поскольку праймеры, даже абсолютно уникальные для тех или иных последовательностей ДНК, могли отжигаться и на неспецифичных участках, не относящихся к анализируемому гену, нами выполнялась проверка соответствия праймеров последовательностям целевого гена. С этой целью использовали online сервис NCBI Primer BLAST и оценивали локальное попарное выравнивание каждого из праймеров со всеми нуклеотидными последовательностями баз данных Refseq. Результаты. В результате проведенных исследований по подбору оптимальной температуры отжига праймеров, концентраций праймеров, а также подбору оптимальной пары нуклеотидов были определены основные параметры сконструированных праймеров. Выводы. Создан набор для обнаружения и количественной оценки ДНК TTV методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, который стал основой для разработки коммерческой тест-системы.
Литература
Bisceglie AMD. TT virus and other anelloviruses [Internet]. UpToDate. 2023. Available from: https://www.uptodate.com/contents/tt-virus-and-other-anelloviruses/print.
Family – Anelloviridae. In: King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, Lefkowitz EJ editors. Virus Taxonomy. Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Amsterdam: Elsevier; 2012. p. 331-341. doi: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-384684-6.00033-1.
Gore EJ, Gard L, Niesters HGM, Van Leer Buter CC. Understanding torquetenovirus (TTV) as an immune marker. Front Med (Lausanne). 2023;10:1168400. https://doi.org/10.3389/fmed.2023.1168400.
Sarairah H, Bdour S, Gharaibeh W. The Molecular Epidemiology and Phylogeny of Torque Teno Virus (TTV) in Jordan. Viruses. 2020;12(2):165. https://doi.org/10.3390/v12020165.
Pachot A, Venet F, Monneret G, Lepape A, Rimmelé T, Tan LK, Brengel-Pesce K, Textoris J. Herpes DNAemia and TTV Viraemia in Intensive Care Unit Critically Ill Patients: A Single-Centre Prospective Longitudinal Study. Front Immunol. 2021;12:698808. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.698808.
Maev IV, Karlovich TI, Burmistrov AI, Chekmazov IA, Andreev DN, Reshetnyak VI. Sovremennye predstavlenija o roli Torque Teno Virus (TTV) pri zabolevanijah pecheni [Current Views of Torque Teno Virus (TTV) in Liver Diseases]. Rossijskij zhurnal gastrojenterologii, gepatologii, koloproktologii [Russian Journal of Gastroenterology, Hepatology, Coloproctology]. 2020;30(4):7-22. https://doi.org/10.22416/1382-4376-2020-30-4-7-22. https://elibrary.ru/ovawzn. (Russian).
Focosi D, Antonelli G, Pistello M, Maggi F. Torquetenovirus: the human virome from bench to bedside. Clin Microbiol Infect. 2016;22(7):589-93. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2016.04.007.
Reshetnyak VI, Maev IV, Burmistrov AI, Chekmazov IA, Karlovich TI. Torque teno virus in liver diseases: On the way towards unity of view. World J Gastroenterol. 2020;26(15):1691-1707. https://doi.org/10.3748/wjg.v26.i15.1691.
Kulifaj D, Durgueil-Lariviere B, Meynier F, Munteanu E, Pichon N, Dubé M, Joannes M, Essig M, Hantz S, Barranger C, Alain S. Development of a standardized real time PCR for Torque teno viruses (TTV) viral load detection and quantification: A new tool for immune monitoring. J Clin Virol. 2018;105:118-127. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2018.06.010.
Maggi F, Focosi D, Statzu M, Bianco G, Costa C, Macera L, Spezia PG, Medici C, Albert E, Navarro D, Scagnolari C, Pistello M, Cavallo R, Antonelli G. Early Post-Transplant Torquetenovirus Viremia Predicts Cytomegalovirus Reactivations In Solid Organ Transplant Recipients. Sci Rep. 2018;8(1):15490. https://doi.org/10.1038/s41598-018-33909-7.
Sievers F, Wilm A, Dineen D, Gibson TJ, Karplus K, Li W, Lopez R, McWilliam H, Remmert M, Söding J, Thompson JD, Higgins DG. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 2011;7:539. https://doi.org/10.1038/msb.2011.75.
Focosi D, Macera L, Pistello M, Maggi F. Torque Teno virus viremia correlates with intensity of maintenance immunosuppression in adult orthotopic liver transplant. J Infect Dis. 2014;210(4):667-8. https://doi.org/10.1093/infdis/jiu209.
2.png)
